Нарушение орального барьера（3）

Открытие, оптимизация и последующая модификация ПН-235 (икотрокинра, JN-2113)

Преимущества пероральных циклических пептидов были подробно описаны в предыдущих статьях, при этом PN-235 получил значительное внимание как один из очень немногих препаратов циклических пептидов, доступных в настоящее время для перорального применения. 21 июля 2025 года Протагонист и Янссен объявили, что подали в FDA заявку на новое лекарство (NDA) для Икотрокинры для лечения бляшечного псориаза средней и тяжелой степени у взрослых и детей в возрасте 12 лет и старше. Ожидается, что в случае одобрения Икотрокинра станет первым в мире пероральным препаратом, нацеленным на IL-23R, для лечения псориаза. В этой статье основное внимание уделяется процессу открытия и стратегиям систематической оптимизации этой молекулы с использованием дат публикации патентов в качестве временной шкалы, а также обобщаются потенциальные направления дальнейшей оптимизации.

Еще в 2007 году компания Valorisation Hsj, Societe En Commandite, подала заявку на патент на антагонисты пептида IL-23R (WO2009007849). Это один из первых патентов, касающихся антагонистов пептида IL-23R, в общедоступной информации. В этом патенте описана серия пептидов, нацеленных на IL-23R, включая агонист APG-2301 и антагонисты APG-2303, APG-2305, APG-2307 и APG-2309 (последовательности показаны на рисунке ниже). Команда использовала аминокислотную последовательность IL-23R в качестве основы в сочетании с методами компьютерного моделирования для создания линейных пептидов, соответствующих его шарнирной области (имитирующих IL-23 и действующих как антагонисты IL-23R). Среди них APG-2305 и APG-2309 эффективно ингибировали фосфорилирование STAT3 в спленоцитах мыши in vitro со значениями IC50 1 нМ и 2 нМ соответственно. Кроме того, на крысиной модели воспалительного заболевания кишечника лечение APG-2309 значительно облегчало вызванные воспалением отек и покраснение, а также значительно уменьшало инфильтрацию лейкоцитов слизистой оболочки и застой сосудов, демонстрируя хороший противовоспалительный и терапевтический потенциал.

В 2013 году компания Medical Diagnostic Laboratories (MDL) опубликовала патент (US20130029907), описывающий открытие IL-23R-связывающих пептидов с использованием технологии фагового дисплея, успешно идентифицировав несколько пептидных последовательностей, которые специфически связываются с IL-23R. В ходе этого исследования была создана библиотека фагового дисплея M13, содержащая случайные 12-мерные пептидные последовательности, и проведено несколько раундов скрининга с использованием полноразмерного растворимого рекомбинантного IL-23R и его вариантов сплайсинга в качестве мишеней. В конечном итоге было идентифицировано 27 пептидов со связывающей активностью. Примечательно, что эти пептидные последовательности показали низкое сходство с кристаллической структурой IL-23, о которой сообщили Beyer et al. (ID PDB: 3D85). Путем выравнивания последовательностей исследователи обнаружили, что 66,7% пептидов содержат консервативную последовательность распознавания: -WX1X2X3W-, которая, как предполагалось, является ключевым функциональным мотивом для связывания с IL-23R и блокирования его последующей сигнальной трансдукции (репрезентативная последовательность показана на рисунке ниже). Впоследствии исследователи оценили ингибирующую активность пептидов в отношении связывания IL-23 с IL-23R с помощью конкурентных экспериментов ELISA, определив Пептид 23 (12-мерный пептид) как наиболее активный пептид, который значительно ингибировал связывание IL-23 с IL-23R (IC50=0.85 мкМ).

Основываясь на этом, команда оптимизировала структуру пептида 23, включая удлинение или укорочение C/N-концев, замену внутренних аминокислот кислыми/нейтральными/основными аминокислотами и модификации циклизации. Результаты конкурентного ИФА показали, что удлинение аминокислот на обоих концах Пептида 23 мало влияло на его ингибирующую активность, но укорочение приводило к снижению ингибирующей активности. Модификация зарядовых свойств остатков «X» в основном мотиве -WX1X2X3W- (например, замена отрицательно заряженных остатков другими отрицательно заряженными, полярными незаряженными или положительно заряженными остатками) не оказала существенного влияния на его ингибирующую активность, что указывает на то, что зарядовые характеристики остатков в этой области не являются ключевыми детерминантами связывающей активности. Замена одного из остатков триптофана (W) в основной структуре на фенилаланин (F) или тирозин (Y) сохранила его ингибирующую способность, тогда как замена на аланин (А) снизила активность, что согласуется с характеристиками последовательности, полученными в результате предыдущего скрининга фагового дисплея.

Более того, укорочение пептида 23.15 при сохранении основной структуры -WQDYW-, хотя основной мотив и сохранялся, значительно ослабляло его ингибирующую активность. Кроме того, введение цистеина (Cys) на оба конца с образованием циклического пептида приводило к активности, сравнимой с активностью линейного пептида; однако уменьшение размера циклического пептида до 7 или 9 пептидов при сохранении основной структуры значительно ослабляло его способность ингибировать IL-23R.

В двух последующих патентах, опубликованных MDL (US20130172272 и US20160039878), исследователи использовали базовую структуру -WX1X2X3W- в качестве каркаса, а также создали и протестировали целевую пептидную библиотеку с использованием технологии рибосомного дисплея (последовательность пептидной библиотеки: XXXWXXYWXXXX). После восьми раундов скрининга пептиды были дополнительно разделены на основе структуры -WX1X2YW-: группа A содержала -WVDYW-, группа B содержала -WQDYW-, а группа C содержала пептиды с другими основными последовательностями. Тесты активности ELISA показали, что пептид №. 2/7 в группе А имел более высокую активность по сравнению с пептидом №. 23.19, раскрытым в предыдущем патенте. В конкурентных тестах ELISA пептид №. 7 имел IC50 58,0 нМ, а пептид №. 2 имел IC50 34,6 нМ.

Впоследствии, используя пептид №2 и пептид №7 в качестве отправной точки, были разработаны и синтезированы три циклических пептида: 2HT-AA, 7-CC и 7HT-AA. Среди них молекула 2HT-AA, основанная на циклизации остатков аланина от головы-к-хвосту на обоих концах пептида NO.2, показала лучшую активность (структура показана на рисунке ниже), с конкурентным ИФА IC50 8,1 нМ и репортерной активностью 341,8 нМ (метод тестирования: IL-23 стимулировал DB клеточную линию, трансфицированную репортерным геном STAT3, и ингибирующую активность количественно определяли путем определения экспрессии репортерного гена). Это представляло собой 4-6-кратное увеличение активности по сравнению с линейным пептидом. В тестах активности in vitro 2HT-AA эффективно ингибировал индуцированную IL-23 секрецию IL-17F в клетках Th17 человека в зависимости от концентрации и блокировал выработку IL-22 в РВМС человека и спленоцитах крысы. Одновременно этот циклический пептид также подавлял уровни мРНК IL-17F в спленоцитах крыс. К сожалению, несмотря на многообещающую фармакологическую активность 2НТ-АА, последующих отчетов об оптимизации структуры этого циклического пептида и его производных с помощью MDL обнаружено не было.